浅析乳制品中三聚氰胺检测能力验证

   学文网   2017-01-09 00:00:00

  摘要:本文要以国家认监委组织的三聚氰胺能力验证为契机。以岛津液相lc-10a配紫外检测器为例,以离子对试剂缓冲液/乙腈水溶液为流动相,通过改变流动相的配比, 从而调节该物质的最佳分离度,优化仪器条件,来提高工作效率。并对乳制品样品的前处理方法进行探讨和改进.
  关键词:乳制品 三聚氰胺 检测 高效液相色谱 离子对试剂 加标回收率 探讨
  
  引言:三鹿奶粉事件发生以来,三聚氰胺检测工作量急剧增加,检测要求越来越高。为了验证检测实验室的检测技术能力,强化检测实验室监督管理,国家认证认可监督管理委员会于2008年10月中旬开展了这次能力验证活动。在此次能力验证活动中,阿克苏地区质量与计量检测所的"乳品中三聚氰胺检测"能力验证项目获得"满意"结果,表明该所三聚氰胺的检测能力符合国家有关要求,能够完全满足三聚氰胺检测的需要。就本次能力验证采用高效液相色谱法做一些实验探讨。
  三聚氰胺(化学式:c3h6n6)呈弱碱性,能溶于甲醛、乙酸等,微溶于水和醇,不可用于食品加工或食品添加物。三聚氰胺可用于生产食品包装材料、农药和化肥,可能从环境、食品包装材料等途径进入到食品中,在产品中检出微量属于正常。三聚氰胺的含氮量为66%左右,常被不法商人添加到食品中,以提升检测中蛋白质的含量指标。
  一:原 理
  试样用三氯乙酸溶液-乙腈提取,经阳离子交换固相萃取柱净化后,用高效液相色谱测定,外标法定量。
  仪器与试剂
  仪器 岛津高效液相色谱仪lc-10a、电子分析天平(感量为0.0001g)、电子天平(感量为0.01g)、离心机、超声波清洗器、旋涡混合器、固相萃取装置、氮吹仪、真空泵、50 ml具塞塑料离心管等。
  试剂与材料 试验用水均符合gb/t 6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》一级水;甲醇、乙腈(色谱纯);氨水、柠檬酸(优级纯);辛烷磺酸钠:纯度大于98.0%;50%甲醇水溶液;1%三氯乙酸溶液;5%氨化甲醇溶液;离子对试剂缓冲液:准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠,加入约980 ml 水溶解,调节ph 至3.0 后,定容至1l 备用;三聚氰胺标准品:纯度大于99.0%;1 mg/ml的三聚氰胺标准储备液(用1+1甲醇-水溶液溶解定容);阳离子交换固相萃取柱:临用前依次用3 ml甲醇和5 ml 水活化;微孔滤膜:0.2μm,有机相;氮气:纯度大于99.999%等。
  二:仪器工作条件
  色谱柱:c18柱,250 mm×4.6 mm,5 μm(大连中汇达科学仪器有限公司) ;流动相:离子对试剂缓冲液-乙腈(90+10,v/v);流速:1.0 ml/min;柱温:40℃;波长:240 nm ;进样量:20 μl。
  三: 分析方法
  1.标准曲线的绘制 用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为
  0.5、 1、2、4、8、16 μg/ml 的标准工作液,以峰面积-浓度作图,得到标准曲线回归方程。
  2.样品的测定
  提取 称取2 g(精确至0.0001 g)试样于50 ml具塞塑料离心管中,加入15 ml1%三氯乙酸溶液和5 ml乙腈,超声提取10 min,再振荡提取10 min后,以4000 r/min离心10 min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后,用三氯乙酸溶液定容至25 ml,移取5 ml滤液,加入5 ml水混匀后做待净化液。
  净化 将上一步骤中的待净化液转移至固相萃取柱(strata -x 系列spe小柱,临用前已经活化)中。依次用3 ml水和3 ml甲醇洗涤,抽至近干后,用6 ml5%的氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1 ml/min。洗脱液于40℃下用氮气吹近干,用1 ml流动相定容,涡旋混合1 min,过微孔滤膜后,供hplc测定。
  待测样液中三聚氰胺的响应值应在标准曲线线性范围内,超过线性范围则应稀释后再进样分析。
  实验结果
  1.lc-10a高效液相色谱仪所测三聚氰胺标准曲线结果。三聚氰胺标准系列浓度为0.5、 1、2、4、8、16 μg/ml ,三聚氰胺峰面积为36965,74270,148093,292119,583420,1180109,相关系数r=0.999959。
  
  2、加标回收率试验。在不含三聚氰胺的奶样中分别加入浓度为2.0和8.0 μg/ml的三聚氰胺标准溶液,测得加标后的样品浓度和为1.85和7.80 μg/ml, 三聚氰胺回收
  率为92.5%和97.5%,得到了很好的回收率。
  四、结果讨论
  1.离子对试剂缓冲液选择。离子对试剂选择庚烷磺酸钠要优于辛烷磺酸钠。一般来说,碳链短的比碳链长的分离度要好,而且碳链越长,离子对试剂和柱子的平衡时间越长,柱子越不易冲洗,对柱子损害越大。
  2.离子对试剂缓冲液ph值的选择。c18柱使用的缓冲液ph值范围在2~9.5之间,太高的ph值,会使色谱柱硅胶溶解,太低的ph值,会使色谱柱键合的烷基脱落。所以离子对试剂缓冲液ph值选择3.0 。
  3.流动相比例的选择。流动相(离子对试剂缓冲液和乙腈)的比例应根据仪器和选择的色谱柱作相应的调整,以达到最好的色谱分离。原则是尽量延长三聚氰胺的出峰时间,以便更好地分离杂质和目标物。乙腈含量一般控制在10%左右,乙腈比例越大,出峰时间越快。
  五.注意事项。
  1、样品为奶粉,在称取样品后,用三氯乙酸溶液将奶粉彻底溶开后再加入5ml乙腈,混匀后再通过超声提取蛋白质。为提取彻底,可以适当延长超声提取的时间。
  2、离心机转速最好不低于8000 r/min,否则离心效果差,影响过滤效果。
  3、固相萃取柱在临净化前,一定要先活化,过柱时不能等流干之后再加溶剂,防止气泡进入,影响净化和萃取效果;控制整个萃取过程流速稳定且不得超过1ml/min(一般控制在25滴/分),否则影响去除杂质和洗脱三聚氰胺的效果。
  4、仪器的平衡:因为流动相中添加了一定量的离子对试剂,大概需要3h~5h仪器才能达到稳定的状态。
  5、分离:选择合适的流动相比例,原则是尽量延长三聚氰胺的出峰时间,以便更好地分离杂质和目标物。
  6、当检出阳性样品的峰不规则时,应认真判断是否是杂峰或是与杂峰重叠和污染。方法是从样品瓶中转移出一部分样液,加标后再进针判断,或与有质谱的实验室进行比对。
  参考文献:
  [1]中华人民共和国国家标准,原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法 (gb/t 22388-2008),北京:中国标准出版社,2008
  [2] 张晓彤,云自厚。 液相色谱检测方法 [m] 北京:化学工业出版社 2000
  [3] 于世林。 高效液相色谱方法及应用 [m] 北京:化学工业出版社 2000
  [4] 中华人民共和国国家标准,分析实验室用水规格和试验方法 (gb/t 6682-2008),北京:中国标准出版社,2008


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